Как сдавать анализы на гепатит C?

Во время планового обследования проводится сдача крови для общего и биохимического анализа. Такое исследование дает общую информацию о состоянии человека, а также может указать на наличие воспалений в определенном органе. В частности, на гепатит намекает повышение билирубина и печеночных трансаминаз (АсАт, АлАт, ЩФ). Однако для выявления гепатитных маркеров, определения типа, генотипа и вирусной нагрузки необходимо делать специальный анализ крови на гепатит C.

Показания к проведению анализа

Сдача анализа крови на гепатит C не является обязательной при плановом медосмотре, поэтому такое исследование проводится по таким показаниям:

• в биохимическом анализе наблюдается существенное повышение уровня печеночных трансаминаз и лейкоцитов, что свидетельствует об острой фазе воспалительного процесса в печени;
• планирование семьи и беременность;
• появление характерных астенических и диспепсических проявлений хронического гепатита;
• группа риска: медперсонал, наркоманы, лица, находящиеся в местах лишения свободы, пациенты, которым необходимо частое переливание донорской крови.

Перед проведением диагностики нет необходимости придерживаться специальных правил. Достаточно отказаться от алкоголя, жирной и жареной пищи за пару дней до похода в больницу. Накануне вечером нужно съесть легкий ужин не позднее 20:00, а утром необходимо сдавать анализ натощак. Все это поможет повысить достоверность результатов.

Иммуноферментный анализ

Основным методом диагностики гепатита C является твердофазный иммуноферментный анализ, который определяет болезнь посредством связи «антиген – антитело». Выделяют несколько основных маркеров вирусной инфекции, имеющих разное диагностическое значение:

• анти-core — считается одним из самых надежных признаков наличия болезни, поскольку ассоциируется с репликацией вируса и сопровождает РНК патогена;
• анти-NS3 — эти титры наблюдаются в большом количестве в крови при острой фазе HCV-инфекции, а также при хронизации патологического процесса. Большая концентрация анти-NS3 обычно характеризует высокую вирусную нагрузку;
• анти-NS4 — эти маркеры определяют длительность воспалительного процесса, а потому напрямую связаны со степенью поражения печени;
• анти-E1/E2 — прогноз клинической картины зависит от того, на каком этапе заболевания были выявлены эти титры. Если они обнаружены в течение первого месяца протекания острой фазы и начинают медленно понижаться, то организм самоочищается от вируса и переходит в стадию «здорового носительства». Если же анализ показал высокие маркеры анти-E при хроническом гепатите C, то патоген активно размножается.

В отличие от других вирусных гепатитов, при HCV-инфекции медики не могут использовать в диагностических целях данные о концентрации иммуноглобулинов IgM и IgG. Это обусловлено специфичностью антителообразования при данном заболевании, в частности, IgM может проявиться гораздо позднее IgG, из-за чего данные структуры нельзя воспринимать как гепатитные маркеры. Однако обнаружение в крови человека IgM на протяжении трех лет указывает на высокую выживаемость вируса в организме либо на обострение инфекции при хронической форме.

Спрогнозировать течение заболевания по результатам ИФА можно, используя такую таблицу:

Под понятием «здоровое носительство» многие понимают выздоровление от гепатита C, однако последние исследования показывают, что у таких людей все равно остается вероятность развития болезни. Существуют данные о том, что патоген может отсутствовать в крови, но сохраняться в лимфатической системе и тканях печени. Поэтому обнаружение антител при отсутствии РНК вируса называют «здоровым носительством».

Причины ложных результатов

Хотя производители тест-систем для проведения иммуноферментного анализа на гепатит C стараются совершенствовать свою продукцию и повышать ее диагностическую чувствительность, частота ложных результатов остается высокой (10–30% по данным разных авторов). Это обусловлено специфичностью проявления антител при HCV-инфекции.

При ложноположительном результате тест показывает наличие обоих типов антител, что трактуется как развитие острой фазы болезни. Однако тест-система может уловить схожие белковые структуры, которые вырабатываются при других заболеваниях: опухоли, аутоиммунные процессы, бактериальные инфекции и др. К примеру, изменение молекулярного состава крови беременных приводит к ложноположительному результату, поэтому при вынашивании плода рекомендуется сделать несколько тестов и подтвердить либо опровергнуть диагноз с помощью ПЦР.

Ложноположительные результаты ИФА составляют 15% от всех положительных результатов.

Ложноположительные результаты обычно возникают, когда иммунная система начинает реагировать сразу против нескольких видов патогенов. К примеру, для людей с ревматоидным артритом достоверность ИФА снижается на 30%. У новорожденных ложный результат может наблюдаться при перекрестном синтезе иммуноглобулинов M к иммуноглобулинам G, находящимся в организме матери.

Ложноотрицательные результаты встречаются реже и, как правило, у людей с ВИЧ, а также по причине несоблюдения надлежащих лабораторных условий. Самыми частыми нарушениями во время выполнения анализа на гепатит C являются:

• нарушение порядка нанесения разводящего средства и времени инкубации образца для получения соответствующей реакции;
• нарушение условий подготовки, хранения и перевозки биоматериала;
• использование просроченных тест-систем;
• плохая стерилизация и очистка лабораторной посуды (особенно часто наблюдаются нарушения обработки наконечников, которые используются для управления активными веществами);
• использование разных серийных компонентов тест-систем (разные производители применяют для производства диагностических тестов свои активные вещества);
• проведение анализа на «постоявшем» биоматериале.

Самые достоверные результаты получаются, когда анализы на гепатит C делаются сразу после забора крови. Свежеприготовленные образцы являются на 100% «живыми», поэтому адекватно отвечают на биохимические воздействия. Но сейчас многие больницы сотрудничают с внешними коммерческими диагностическими центрами, куда отвозят биоматериал. Кровь, взятая для ИФА, может храниться не более 5 суток при температуре 0–4ºС либо ее замораживают. Но даже в случае соблюдения нормальных условий хранения и транспортировки такая кровь подвергается изменениям, а потому вероятность ложного результата повышается.

Тест RIBA

Если ИФА дал положительный анализ на гепатит C, то для исключения ложного результата проводится дополнительное исследование в виде теста RIBA (рекомбинантный иммуноблоттинг). Цель такой лабораторной диагностики остается прежней — обнаружение специфических антител, однако методика проведения несколько отличается от ИФА.

Предварительно берутся антигены вируса HCV и с помощью иммунофореза распределяются по фракциям на нитроцеллюлярной мембране с учетом молекулярного веса. Таким образом, носители антигенных маркеров распределяются по образцу полосами, а не «кляксой», как в случае с ИФА. Поэтому иммуноферментная реакция проявляет не смесь антигенов, а конкретные маркеры, благодаря чему RIBA является более чувствительным и достоверным тестом по сравнению с ИФА.

ПЦР-анализ

Однако важнейшее диагностическое значение в выявлении гепатита C остается за анализом ПЦР (полимеразная цепная реакция). Достоверность данного метода составляет 99,9%, поскольку кровь исследуется не на наличие антител, которые могут появиться лишь через несколько месяцев после заражения, а на наличие РНК вируса в организме. Таким образом, ПЦР покажет, инфицирован ли человек, уже на третий день после потенциального заражения.

ПЦР получила широкое применение в медицине: в диагностике заболеваний (наследственных, врожденных, аутоиммунных, криптогенных, инфекционных), в установлении отцовства, в клонировании и мутагенезе генов. Однако при гепатите C такой анализ назначается только после нескольких положительных или противоречивых реакций ИФА и RIBA из-за сложности выполнения диагностики и дороговизны процедуры. Если для обнаружения антител достаточно провести химические реакции, то для выполнения ПЦР нужны не только специфические знания, но и современное оборудование. Процедура выполняется в несколько этапов:

1. «плавление ДНК» — выделенную из организма двухцепочную матрицу ДНК нагревают в течение 30–120 секунд при температурах 96–98ºС для «разведения» полимеразных цепей. Чтобы разрушение водородных связей происходило «мягче», образец заранее прогревают при более низких температурах в течение 2–5 минут;
2. «отжиг» — после расслоения ДНК проводится ее отжиг при температуре 60–70ºС для связывания праймеров с одноцепочной матрицей;
3. элонгация — на этой стадии начинается копирование специфических фрагментов ДНК, которые представляют диагностический интерес. Для получения количественной информации о концентрации вирусных фрагментов в организме человека проводится несколько циклов финальной элонгации.

Несмотря на политику бесплатной медицины в странах СНГ, ПЦР-тест проводят только коммерческие диагностические центры. Причем такой анализ будет стоить в 3–5 раз дороже, чем ИФА. Однако он не только подтвердит диагноз, но и определит степень тяжести патологического процесса по вирусной нагрузке.